21-02-2006, 11:13
cetace a écrit :As-tu inclu un détergent anionique dans la solution appropriée?
Cette diminution s'effectue vraisemblablement au niveau des interactions hydrophobes entre anticorps et membrane de nitrocellulose.Je te conseille d'utiliser le Tween20 à 0.1 %. :ange:
Le Tween20 agit comme supplément aux agents bloquants mais ne peut pas les substituer.
La membrane de nitrocellulose doit être lavée pour limiter les liaisons non-spécifiques. Le sais-tu ?;)
Pour cela, les volumes de lavages doivent être suffisants pour créer un flux léger (mais pas trop important) à la surface de la membrane. · La température d'incubation de 4°C diminue considérablement le nombre de liaisons non spécifiques.
La quantité exacte d'anticorps à utiliser dépend largement de son titre. Généralement, il est préférable de commencer à utiliser de petites quantités d'anticorps.Mais toi tu veux tout tout de suite!
Des quantités excessives d'anticorps tendent à augmenter le bruit de fond plus que la sensibilité de la technique. Les liaisons non spécifiques peuvent souvent être réduites par diminution de la quantité d'anticorps utilisée pour sonder la membrane...
Au niveau du détergent, j'utilise le nonidet P40 qui permet de casser les membranes cellulaires sans toucher aux récepteurs et autres protéines membranaires.
Ensuite, bien entendu que je met du Tween 20 % , tu crois quoi ? Sinon, je joue sur le temps de saturation, qui est plus important pour bloquer les sites de fixation non spécifiques.
Pour mon marquage, je met le premier anticorps à room temperature (pas +4°) et overnight sinon, je peux pas assurer le mélange.
Pour la quantité, je dilue au 1000è, ce qui fait du 1 microgramme/ml à peu près.
sinon, je crois qu'on peut jouer aussi sur le temps d'exposition au niveau de la révélation lors du développement photographique.... Non ?